ニトロゲナーゼ (nitrogenase, EC 1.18.6.1) はリゾビウム (Rhizobium) 属（根粒菌）など窒素固定を行う細菌が持っている酵素。大気中の窒素をアンモニアに変換する反応を触媒する。全体構造は活性中心を有するニトロゲナーゼ二量体およびニトロゲナーゼ二量体に電子を供与するニトロゲナーゼ還元酵素からなる。極めて酸素に弱く、酸素に触れると数分間で不可逆的に失活する。そのため、本酵素を有する生物にはそれぞれ空気中の酸素からニトロゲナーゼを隔離する機構が見られる。
反応 窒素固定反応において最も特徴的なのが、窒素分子の強固な三重結合を解離し無機窒素化合物に変換する点にある。この三重結合は極めて安定であり、化学的に窒素からアンモニアを合成するハーバー・ボッシュ法の反応条件によっても裏付けられている。 N2 + 3H2 → 2NH3 (ΔG = -8 kcal/mol N2; 450 ℃、200 atm) 上述の条件における反応は発エルゴン的だが、高温高圧条件下のみで行われる。一方、生物による窒素固定反応は基本的には標準状態（25 ℃、1 atm、pH 7.0）にて行われる。ニトロゲナーゼの担う標準状態におけるアンモニア生産反応は下記の式にて表される。 N2 + 6H+ + 6e- + 12ATP + 12H2O → 2NH3 + 12ADP + 12Pi (ΔG’ = -136 kcal/mol N2)・・・反応式1田宮信雄、八木達彦(1991)コーン・スタンプ生化学 第5版 水素に代わり、電子供与体（フェレドキシンなど）からの電子および高エネルギーリン酸化合物の加水分解のエネルギーを用いてアンモニア生産反応を行う。ニトロゲナーゼ系における反応は標準状態であるにもかかわらず発エルゴン的であり、その自由エネルギー変化は極めて大きい。 窒素固定化 ニトロゲナーゼの窒素固定反応は以下のように表される。大気中の窒素を還元し、アンモニアとして固定化する。アンモニアとして固定された窒素は他の細菌によってグルタミン酸塩や硝酸塩に変換され、植物が利用可能な形となる。 N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi・・・反応式2 上述のアンモニア生産反応との相違点は、ニトロゲナーゼの反応特異性の低さによる。ニトロゲナーゼの代表的な副反応の一つとしてATPの加水分解と共役したプロトン還元活性（水素生産）があり、本活性は還元的ATPアーゼ活性と呼ばれている。 2H+ + 2e- + 4ATP + 4H2O → H2 + 4ADP + 4Pi・・・反応式3 この還元的ATPアーゼ活性と反応式1が合わさり、見かけのニトロゲナーゼ活性である反応式2の反応が得られる。なお、反応式2は至適条件における式であり、実際の生理状態においては20 - 30ATPが必要であるとされているR. H. Burris (1991) Nitrogenases, J. Biol. Chem., 266 (15), 9339-9342。 副反応 還元的ATPアーゼ活性にも示されるようにニトロゲナーゼは反応特異性が低く、様々な窒素あるいは有機化合物を触媒できる。主要なものとして、一酸化二窒素、シアン、アセトニトリル、アジド、アセチレン、シクロプロペン、シアナミドそしてジアジリンなどがあるJ. M. Rivera-Ortiz and R. H. Burris (1975) J. Bacteriol., 123, 537-545。 N2O + 2H+ + 2e- → N2 + H2O CN- + 7H+ + 6e- → CH4 + NH3 CH3NC + 6H+ + 6e- → CH3NH2 + CH4 N3- + 3H+ + 2e- → N2 + NH3 C2H2 + 2H+ + 2e- → C2H4 CH2CHCH + 2H+ + 2e- → CH2CH2CH2 H2N-CN + 6H+ + 6e- → NH3 + CH3NH2 CH2NN + 6H+ + 6e- → CH3NH2 + NH3 上記の反応の中で窒素を生産する一酸化二窒素のみが拮抗阻害剤であり、他の基質は非拮抗阻害剤となる。一酸化二窒素の還元によって生じた窒素は、そのまま通常の窒素固定化反応に用いられる。アセチレン還元反応はニトロゲナーゼの簡易測定法として有効であり、生じたエチレンをガスクロマトグラフィーによって分析することによってニトロゲナーゼ活性を検出することができる。また、根粒菌による窒素固定化について、窒素の安定同位体である15Nを蓄積する現象が知られているが、その理由については現在説明は得られていないRasmussen, L. J., Peters, G. K., and Burris, R. H. (1989) Phykos 28, 64-79Yoneyama, T., Yamada, N., Kojima, H., and Yazaki, J. (1984) Plant Cell Physiol., 25, 1561-1565。 電子供与体 ニトロゲナーゼ反応に用いられる電子は主要な代謝系（発酵、ピルビン酸の酸化など）によって還元された電子伝達体によって供与される。嫌気性のグラム陽性菌であるClostridium pasteurianumはフェレドキシンを電子供与体として用いているL. E. Mortenson, (1964) Biochim. Biophys. Acta, 81, 473-478。また、Azotobacter vinelandiiのような共生的な窒素固定微生物は、フェレドキシンと比べて酸化還元電位の高いフラボドキシンを用いているShah, V. K., Stacey, G., and Brill, W. J. (1983) J. Biol. Chem. 258, 12064-12068。また、根粒菌やThiocapsa roseopersicinaのような光合成細菌においては、還元的ATPアーゼ活性によって生じた水素をuptake-ヒドロゲナーゼによって再酸化し、電子供与体の再還元に用いているB. Fodor, G. Rakhely, A. T. Kovacs and K. L. Kovacs (2001) Transposon mutagenesis in purple sulfur photosynthetic bacteria: identification of hypF, encoding a protein capable of processing [NiFe] hydrogenases in alpha, beta, and gamma subdivisions of the proteobacteria, Appl. Environ. Microbiol., 67, 2476-2483。
分布 ニトロゲナーゼは原核生物（細菌、古細菌）に広く分布しており、ゲノム解析や微生物生態学的アプローチからもその分布範囲は拡大の一途をたどっているYoung, J. P. W. 1992. Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms, p. 43-86. In G. Stacey, R. H. Burris, and H. J. Evans (ed.), Biological nitrogen fixation. Chapman and Hall, New York, N.Y.。しかしながら、窒素固定の研究の特に進んでいる微生物群については嫌気性細菌、シアノバクテリアそして根粒菌が主としてあげられる。また、その生活様態から共生的窒素固定生物と非共生的窒素固定生物に分類される桜井英博、柴岡弘郎、清水碩(1997)植物生理学入門、培風館。
非共生的窒素固定生物 絶対嫌気性細菌・・・Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum 通性嫌気性細菌・・・Klebisiella, Bacillus 好気性細菌・・・Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia 光合成細菌・・・Chromatium, Rhodospirillum, Rhodobacter シアノバクテリア・・・Anabaena, Nostoc, Gloeocapsa 共生的窒素固定細菌 根粒菌(Rhizobium) エンドウ根粒菌・・・R. legminosarum（エンドウ、ソラマメ） サイトウ根粒菌・・・R. phaseoli（インゲン） ダイズ根粒菌・・・R. japonicum（ダイズ） クローバー根粒菌・・・R. trifolii（クローバー） ルーピン根粒菌・・・R. lupini（ルーピン） アルファルファ根粒菌・・・R. meliloti（ウマゴヤシ、シナガワハギ） カウピー根粒菌・・・“Cowpea rhizobia”（カウピー、ナンキンマメ、アズキ） Frankia・・・未分離（ハンノキ、モクマオウ、グミ、カルフォルニアライラック） シアノバクテリア・・・Anabaena（地衣類、アカウキクサ） 一方で真核生物からはニトロゲナーゼ系を含む窒素固定系は見出されていないLuis M. Rubio and Paul W. Ludden (2005) Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle, J. Bacteriol., 187, 405-414。 分類 ニトロゲナーゼは活性中心に含まれる金属の種類によって3つに分類される。主要なニトロゲナーゼ群はモリブデンを活性中心に有するモリブデン含有ニトロゲナーゼである。多くの窒素固定菌が本ニトロゲナーゼを有しており、自然界にて行われている窒素固定のほとんどは本酵素によるものと考えられている。残る二つの群はバナジウムおよび鉄をそれぞれ活性中心に含んでおり、それぞれバナジウム含有(Vanadium containing)ニトロゲナーゼおよび鉄型(Fe-only)ニトロゲナーゼと呼ばれているBishop, P. E., D. M. L. Jarlenski, and D. R. Hetherington. 1980. Evidence for an alternative nitrogen fixation system in Azotobacter vinelandii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7342-7346。バナジウムおよび鉄を含んでいるニトロゲナーゼは、その全体構造を含めてモリブデン含有ニトロゲナーゼとほぼ同一である。しかしながらその分布は著しく偏っており、モリブデン型が主要なニトロゲナーゼであるのに対して、バナジウムおよび鉄型ニトロゲナーゼは代替ニトロゲナーゼ(Alternative nitrogenase)と呼ばれている。下記に分布の例を挙げる。 モリブデン、バナジウムおよび鉄型ニトロゲナーゼの全てを有する・・・Azotobacter vinelandiiBishop, P. E., R. Premakumar, D. R. Dean, M. R. Jacobson, J. R. Chisnell, T. M. Rizzo, and J. Kopczynski. 1986. Nitrogen fixation by Azotobacter vinelandii strains having deletions in structural genes for nitrogenase. Science 232:92-94 モリブデンおよび鉄型ニトロゲナーゼを有する・・・Rhodobacter capsulatus、Rhodospirillum rubrum Davis, R., L. Lehman, R. Petrovich, V. K. Shah, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Purification and characterization of the alternative nitrogenase from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 178, 1445-1450.Schneider, K., A. Muller, U. Schramm, and W. Klipp. 1991. Demonstration of a molybdenum- and vanadium-independent nitrogenase in a nifHDKdeletion mutant of Rhodobacter capsulatus. Eur. J. Biochem. 195:653-661. モリブデンおよびバナジウム含有ニトロゲナーゼを有する・・・Anabaena variablisThiel, T. 1993. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. J. Bacteriol. 175:6276-6286 モリブデン含有ニトロゲナーゼのみを有する・・・Krebsiella pneumoniaeArnold, W., A. Rump, W. Klipp, U. B. Priefer, and A. Puhler. 1988. Nucleotide sequence of a 24,206-base-pair DNA fragment carrying the entire nitrogen fixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae. J. Mol. Biol. 203: 715-738. 上述のリストのとおり、全ての窒素固定菌はモリブデン含有ニトロゲナーゼを有しており、バナジウムおよび鉄型ニトロゲナーゼのみを有する窒素固定生物はいまだ見つかっていない。また既存のニトロゲナーゼとは全く異なる4つ目のグループが放線菌Streptomyces thoermoautotrophicusから見つかっている。本酵素はモリブドプテリンを活性中心に有しており、サブユニット構成など上述のニトロゲナーゼと全く異なっているRibbe, M., D. Gadkari, and O. Meyer. 1997. N2 fixation by Streptomyces thermoautotrophicus involves a molybdenum-dinitrogenase and a manganese-superoxide oxidoreductase that couple N2 reduction to the oxidation of superoxide produced from O2 by a molybdenum-CO dehydrogenase. J. Biol. Chem. 272:26627-26633。 立体構造 ニトロゲナーゼは活性中心を有するニトロゲナーゼ二量体(Dinitrogenase、Mo-Feタンパク質、component I)およびニトロゲナーゼ二量体を還元するニトロゲナーゼ還元酵素(Dinitrogenase reductase、Feタンパク質、component II)からなる。機能単位はニトロゲナーゼ二量体およびニトロゲナーゼ還元酵素二量体のヘテロ四量体をとっているが、生体内における構造はさらにヘテロ四量体が2つ結合しヘテロ八量体構造にて機能している（最上部の『ニトロゲナーゼの構造』図表参照）。なお、本節では立体構造がよく知られているモリブデン含有ニトロゲナーゼのみについて概説する。
ニトロゲナーゼ二量体 ニトロゲナーゼ二量体の遺伝子はnifDおよびnifKであり、それぞれαおよびβサブユニットをコードしている。αβ構造が機能単位だが、生体内においてはα2β2構造をとっており、分子量は220 - 240 kDa程度である。αβ構造内には、活性中心である鉄-モリブデン補因子(FeMo-co)および電子伝達を担うP-clusterが一つずつ配位している。FeMo-coは[Mo-3Fe-3S]および[4Fe-3S]クラスターが3つの硫黄リガンドによって結合し、[Mo-7Fe-6S]クラスター構造を有している。さらにモリブデンはホモクエン酸のC2カルボニル基とヒドロキシ基に結合し、さらにαサブユニットのシステインとヒスチジンに結合して安定した構造をとっている。一方、P-clusterは2つの[4Fe-3S]クラスターが1つの硫黄リガンドによって結合し、[8Fe-7S]クラスター構造をとっている。それぞれのクラスターの両端はαおよびβサブユニットのシステインに結合し、配位されている。したがって、P-clusterはαβサブユニット間に配置している。
ニトロゲナーゼ還元酵素 ニトロゲナーゼ還元酵素の遺伝子はnifHである。機能単位はホモ二量体であり、分子量は120 kDaである。ニトロゲナーゼ還元酵素内には1つの[4Fe-4S]クラスターおよび2つのMg-ATP結合部位を有している。[4Fe-4S]クラスターはホモ二量体それぞれのシステインによって配位され、P-cluster同様サブユニット間に配置している。一方、Mg-ATP結合部位については、ホモ二量体のサブユニットそれぞれに存在している。
反応機構
1960年にCarnahanらによってC. pasteurianum無細胞標品による窒素固定反応に成功したCarnahan. J. E.. Mortenson. L. E.. Mower. H. F.. and Castle. J. E. (1960) Biochim. Biophys. Acta 38, 188-189Carnahan. J. E.. Mortenson. L. E.. Mower. H. F.. and Castle. J. E. (1960) Biochim. Biophys. Acta 44, 520-535。その後、モリブデン含有ニトロゲナーゼの精製を経て、ニトロゲナーゼが二つのComponent（ニトロゲナーゼ二量体およびニトロゲナーゼ還元酵素）によって機能することが明らかになったMortenson, L. E. (1965) in Non-Heme Iron Proteins: Role in Energy Conversion (San Pietro, A., ed) pp. 243-259, Antioch Press, Yellow Springs OH。その後の精力的な研究により、ニトロゲナーゼは下記の5成分の存在下にて窒素固定反応を行うことが示されたWinter, H. C., and Burris, R. H. (1968) J. Biol. Chem. 243,940-944Orme-Johnson, W. H., Hamilton, W. D., Ljones, T., Tso, M.-Y. W., Burris, R. H., Shah, V. K., and Brill, W. J. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3142-3145Zumft, W. G., and Mortenson, L. E. (1975) Biochim. Biophys. Acta 416, 1-52。 電子供与体（フェレドキシン、フラボドキシン） ニトロゲナーゼ還元酵素（[4Fe-4S]クラスター） ATPおよび2価金属イオン(マグネシウム、カルシウムなど) ニトロゲナーゼ二量体（P-Cluster、FeMo-co） 電子受容体（窒素） なお、上記の順序で電子伝達が行われる。以上5成分の窒素固定反応は下記の順序で行われる。 ニトロゲナーゼ還元酵素にATPおよびマグネシウムが結合し、複合体をとる。この時ニトロゲナーゼ還元酵素の標準酸化還元電位は-400 mV付近まで低下する。 電子供与体からニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体に電子伝達がおこなわれ、本複合体が還元される。 ニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体のATPが加水分解されより低電位の電子となる。結合しているATPはADPとなる。 ニトロゲナーゼ還元酵素-MgADP複合体の[4Fe-4S]クラスターを通じて、ニトロゲナーゼ二量体のP-clusterに電子伝達がおこなわれる。 ニトロゲナーゼ二量他のP-clusterからFeMo-coに電子伝達がおこなわれる。 FeMo-coが窒素を2電子還元するとN2H2を生じる。 FeMo-coがN2H2をさらに2電子還元するとN2H4が生じる。 FeMo-coがN2H4をさらに2電子還元すると2アンモニアが生じる。 窒素の還元を行っている際、同時にプロトンも還元し、水素が発生する。 以上の反応の化学量論式は以下のとおりである。 ニトロゲナーゼ還元酵素 + 2Mg2+ + 2ATP → ニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体（酸化型） 2ニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体（酸化型） + 2e- → 2ニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体（還元型） 2ニトロゲナーゼ還元酵素-MgATP複合体（還元型） + 2ATP → 2ニトロゲナーゼ還元酵素-MgADP複合体（酸化型） + 2ADP + 4Pi + 2e- 1[4Fe-4S]クラスター（酸化型） + 2e- → 1[4Fe-4S]クラスター（還元型）+ 1P cluster（酸化型） → 1[4Fe-4S]クラスター（酸化型） + 1P cluster（還元型） 1P cluster（還元型） + 1FeMo-co（酸化型） → 1P cluster（酸化型） + 1FeMo-co（還元型） 1FeMo-co（還元型） + N2 → N2H2 （1~5の2回目サイクル）1FeMo-co（還元型） + N2H2 → N2H4 （1~5の3回目サイクル）1FeMo-co（還元型） + N2H4 → 2NH3 2H+ + 2e- + 4ATP + 4H2O → H2 + 4ADP + 4Pi なお、FeMo-co活性中心における窒素固定反応スキームについてはいまだ決定打が出ていない。現在のところFeが触媒となる経路や、[Mo-3Fe-3S]および[4Fe-3S]のクラスターをつなぐ窒素原子が触媒となる経路、あるいはモリブデンが触媒部位となる経路など4つのスキームが提案されているJohn W Peters and Robert K Szilagyi (2006) Exploring new frontiers of nitrogenase structure and mechanism. Current Opinion in Chemical Biology, 10:101-108。
関連遺伝子および機能 P clusterやFeMo-coといった複雑な金属クラスターは自発的に構築されず様々なタンパク質が構築に関与している。ニトロゲナーゼ構造遺伝子発現後にタンパク質内にクラスターが配位される発現後プロセッシングを経て活性を発揮するが、この一連の現象を成熟化(maturation)という。また、ニトロゲナーゼは発現に際して様々な調節を受けており、それらにかかわる遺伝子も多数存在する。A. vinelandiiやK. pneumoniaeのニトロゲナーゼ遺伝子の機能解析により、ニトロゲナーゼにかかわる遺伝子の全貌が明らかになってきているDos Santos, P. C., D. R. Dean, Y. Hu, and M. W. Ribbe. 2004. Formation and insertion of the nitrogenase iron-molybdenum cofactor. Chem. Rev. 104:1159-1173Imperial, J., V. K. Shah, R. A. Ugalde, P. W. Ludden, and W. J. Brill. 1987. Iron-molybdenum cofactor synthesis in Azotobacter vinelandii Nif- mutants. J. Bacteriol. 169:1784-1786.Roberts, G. P., MacNeil, T., MacNeil, D., andBrill, W. J. (1978) J. Bacteriol. 136, 267-279。 下記に、これまで明らかになったニトロゲナーゼ関連遺伝子群の名称および機能を列挙する。 nifH・・・ニトロゲナーゼ還元酵素 nifD・・・ニトロゲナーゼ二量体αサブユニット nifK・・・ニトロゲナーゼ二量体βサブユニット nifT・・・機能不明 nifY/nafY・・・ニトロゲナーゼ二量体のシャペロン。FeMo-coの挿入にかかわる。 nifE・・・FeMo-co構築 nifN・・・FeMo-co構築 nifX・・・FeMo-co構築 nifU・・・鉄硫黄クラスター骨格 nifS・・・鉄硫黄クラスターの不安定硫黄の運搬 nifV・・・ホモクエン酸合成酵素 nifW・・・FeMo-co安定化 nifZ・・・機能不明 nifM・・・ニトロゲナーゼ還元酵素の成熟化 nifF・・・フラボドキシン nifL・・・陰性調節因子 nifA・・・陽性調節因子 nifB・・・FeMo-co構築 fdnN・・・フェレドキシン nifQ・・・FeMo-co構築 nifJ・・・ピルビン酸：フラボドキシン（フェレドキシン）オキシドレダクターゼ なお、バナジウム含有および鉄型ニトロゲナーゼも、それぞれvnf遺伝子群(Vanadium Nitrogen Fixation)およびanf遺伝子群(Alternative Nitrogen Fixation)をそれぞれ有し、良く似た機構で発現にかかわっていると考えられているRangaraj, P., C. Ruttimann-Johnson, V. K. Shah, and P. W. Ludden. 2000. Biosynthesis of the iron-molybdenum and iron-vanadium cofactors of the nif- and vnf-encoded nitrogenases, p. 55-79. In E. W. Triplett (ed.), Prokaryotic nitrogen fixation: a model system for analysis of a biochemical process. Horizon Scientific Press, Wymondham, United Kingdom.。また、幾つかの'nif'遺伝子はバナジウム含有および鉄型ニトロゲナーゼで共有されているKennedy, C., and D. Dean. 1992. The nifU, nifS and nifV gene products are required for activity of all three nitrogenases of Azotobacter vinelandii. Mol. Gen. Genet. 231:494-498.。
発現調節